HiPURE高純度質粒小提試劑盒
產(chǎn)品及特點
本試劑盒用于高純度質粒DNA的小量制備。菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低 pH 處理，質 ?？蓮木w中釋放出來，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過清洗液的洗滌可去除 雜質，在低鹽、高pH條件下洗脫，得到純度較高的質粒 DNA 。使用本試劑盒每次 可處理 1-5 ml 過夜培養(yǎng)的菌液，所得質粒可直接用于酶切、轉化、PCR 、測序及轉染等 各種分子生物學實驗。
它具有下列特點：
1. 快捷、高效：操作簡便，得率高，節(jié)約時間。
2. 純度高：沉淀致密，去雜干凈。
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Buffer BL
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25 ml
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50 ml
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100ml
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Buffer S1
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer S2
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer S3
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20ml
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40ml
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80ml
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Buffer W1（concentrate）
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13ml
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26ml
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52ml
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Buffer W2（concentrate）
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer EB
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10ml
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10 ml
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30ml
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RNase A (10 mg/ml)
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150μl
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300μl
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600μl
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Spin Column with Collection Tubes
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50套
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100套
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200套
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注意：使用前將全部 RNase A 溶液加到 Buffer S1 中混合均勻，2 - 8℃保存;按要求在 Buffer W1 和 W2 中加入無水乙醇
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本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于其它用途
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保存條件
在室溫(15-25℃)干燥條件下，可保存 12 個月；更長時間的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液產(chǎn)生沉淀，應在使用前置于 37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1 應置于 2-8℃ 保存，可穩(wěn)定保存 6 個月。
使用方法
柱平衡：
向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入400μl 的平衡液BL ，12,000 rpm (-13,400×g ) 離 心 1 min ，棄收集管中濾液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當天處理過的柱子）
1. 取 1-5 ml 過夜培養(yǎng)的菌液，室溫 12,000 rpm 離心 1 min ，盡量將上清去除干凈。
（注 意：根據(jù)菌液的濃度決定取液量，濃度高時取 1.5 ml 菌液離心即可，濃度低時可多收集一次）
2. 加入 250 μl Buffer S1 ，旋渦震蕩或用移液器充分吹打使菌體重懸均勻。
（注 意：菌體沉淀一定要懸浮均勻，如有未徹底懸浮的菌塊會影響裂解，導致提取的質粒濃度及純度降低）
3. 加入 250 μl Buffer S2 ，溫和顛倒混勻使菌體完全裂解，直到溶液變成清亮、粘稠。
（注 意：不可劇烈震蕩， 以免造成基因組DNA片段的污染，所用時間不要超過5 min ， 以免質粒受到破壞，如未完全變得清亮，可能是菌體太多，可增加Buffer S2的用量，在后續(xù)的操作中 Buffer S3 的用量也要相應增加）
4. 加入350μl Buffer S3 ，立即顛倒混勻6-8次，可見白色沉淀物產(chǎn)生，室溫靜置 2 min， 然后12,000 rpm 離心 5 min。
（注 意：Buffer S3 加入后應立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀）
5. 小心將上清液轉移到離心吸附柱中，12,000 rpm 離心 0.5 min ，棄收集管中濾液。
6. 可選步驟：向吸附柱中加入 500 μl Buffer W1 ，12,000 rpm離心0.5 min ，棄收集管中濾液。
（注 意：Buffer W1 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋， 以防酒精揮發(fā)。如果宿主菌是endA- ，如DH5α或TOP10 ，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+ ，如 TG1 、BL21 、HB101、 JM101等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質粒。如果提取低拷貝質粒也 推薦采用此步驟）
7. 加入 600 μl Buffer W2 ，室溫 12,000 rpm 離心 0.5 min ，棄收集管中濾液。
（注 意：Buffer W2為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋， 以防酒精揮發(fā)）
8. 加入 500 μl Buffer W2 ，室溫12,000 rpm 離心0.5 min ，棄收集管中濾液。
9. 干燥。將離心吸附柱于12,000 rpm 離心 2 min ，甩干殘留漂洗液。
（注 意：此步不能省略，否則殘留乙醇會影響質粒的后續(xù)使用）
10. 將吸附柱置于一新的無菌 1.5 ml 離心管（自備）中，加入 50-100 μl 的洗脫液 Buffer EB， 室溫放置 2 min ，12,000 rpm 離心 1 min ，離心管底溶液即質粒 DNA。
（注 意：為增加洗脫效率，可將洗脫液在60℃預熱。如需使用去離子水洗脫，可用NaOH 調整其pH值在 7.0 - 8.5之間，為了增加質?；厥章剩蓪⒌玫降娜芤褐匦录尤氲诫x心管中，室溫放置 2 min， 再次離心收集）
低拷貝或大質粒（>10 kb）提取
如果所提質粒為低拷貝質粒或大于 10 kb 的大質粒，應加大菌體使用量，使用 5-10 ml 過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加 Buffer S1 、S2 、S3 的用量，洗脫液 Buffer EB 應在 60℃ 水浴預熱，在吸附和洗脫時可以適當延長時間，以增加提取效率。其它步驟相同。
注意事項
1. 細-菌培養(yǎng)時間一般為12-16小時，如接種量大則應減少培養(yǎng)時間，過度培養(yǎng)會降低質粒質量甚至導致質粒DNA突變。
2. 每次使用時都要注意 Buffer S2 和 S3 是否形成沉淀，如有沉淀 37℃溶解后再用。
3. 注意Buffer S1，S2 和 S3的用量比例，若細-菌量增大，需按比例放大這些溶液使用量。
4. 質粒的產(chǎn)量跟細-菌量、質粒拷貝數(shù)、質粒大小和操作規(guī)范程度密切相關，一般 1.5 ml 過 夜培養(yǎng)菌體可收獲約10 μg 高拷貝質粒。
